骨髓间充质干细胞移植治疗炎症性肠病小鼠结肠炎的有效性及肿瘤学安全性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.015

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (23): 3696-3701.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.015

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骨髓间充质干细胞移植治疗炎症性肠病小鼠结肠炎的有效性及肿瘤学安全性

何小文¹，陈泽贤¹，张珑涓²，何晓生¹，练磊¹，柯嘉¹，林绪涛¹，陈曦¹，吴小剑¹，兰平¹

¹中山大学附属第六医院结直肠肛门外科，广东省广州市 510655；²中山大学附属第一医院普通外科实验室，广东省广州市 510080

修回日期:2014-05-08 出版日期:2014-06-04 发布日期:2014-06-04
通讯作者: 张珑涓，主管技师，中山大学附属第一医院普通外科实验室，广东省广州市 510080
作者简介:何小文，男，1978年生，湖北省荆门市人，汉族，2009年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事炎症性肠病的基础和临床研究。共同第一作者：陈泽贤，男，1988年生，广东省汕头市人，汉族，中山大学在读硕士，主要从事炎症性肠病的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81300367，81200332)；广东省自然科学基金资助项目(S2013010014186)

Efficacy and oncological safety of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for colitis in inflammatory bowel disease models in mice

He Xiao-wen¹, Chen Ze-xian¹, Zhang Long-juan², He Xiao-sheng¹, Lian Lei¹, Ke Jia¹, Lin Xu-tao¹, Chen Xi¹, Wu Xiao-jian¹, Lan Ping¹

¹Department of Colorectal and Anal Surgery, the Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510655, Guangdong Province, China; ²Laboratory of General Surgery, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Revised:2014-05-08 Online:2014-06-04 Published:2014-06-04
Contact: Zhang Long-juan, Technician-in-charge, Laboratory of General Surgery, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:He Xiao-wen, M.D., Surgeon, Department of Colorectal and Anal Surgery, the Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510655, Guangdong Province, China Chen Ze-xian, Studying for master’s degree, Department of Colorectal and Anal Surgery, the Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510655, Guangdong Province, China He Xiao-wen and Chen Ze-xian contributed equally to this article.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81300367, 81200332; the Guangdong Provincial Natural Science Foundation, No. S2013010014186

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞输注有望成为临床治疗炎症性肠病的新的有效生物治疗手段，但其肿瘤学安全性问题令人担忧，是决定间充质干细胞能否广泛用于炎症性肠病治疗的关键，亟待研究。

目的：利用小鼠模型观察骨髓间充质干细胞输注对炎症性肠病结肠炎的疗效，并明确间充质干细胞对炎症性肠病炎症癌变的影响。

方法：应用葡聚糖硫酸钠构建Balb/c(H-2d)小鼠的实验性结肠炎模型，经尾静脉输注分离培养的同系基因型骨髓间充质干细胞，对比观察间充质干细胞的疗效并评价结肠炎的组织病理学改善情况；应用葡聚糖硫酸钠联合偶氮氧甲烷构建Balb/c(H-2d)小鼠的结肠炎癌变模型，对比观察间充质干细胞输注后小鼠肠道肿瘤的形成情况。

结果与结论：在葡聚糖硫酸钠结肠炎模型，骨髓间充质干细胞组在实验结束时体质量丧失、大便潜血较PBS组均有减轻；间充质干细胞组中结肠组织炎症损伤严重度评分更低，镜下小鼠远端结肠黏膜结构基本完整，有小范围上皮缺损或隐窝缺损，黏膜层和黏膜下层较多炎症细胞浸润，可见毛细血管和小血管增生；体内示踪可见输注的间充质干细胞向结肠炎症病灶处黏膜下层归巢定殖。在葡聚糖硫酸钠/偶氮氧甲烷结肠炎癌变模型，间充质干细胞组小鼠肠道肿瘤数量及肿瘤负荷均明显小于对照组。结果提示输注骨髓间充质干细胞能明显改善炎症性肠病小鼠的结肠炎症病变，并抑制结肠炎向肿瘤的恶性转化，为间充质干细胞治疗炎症性肠病的生物安全性提供了客观的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 炎症性肠病}, 结肠炎, 癌变, 恶性转化, 治疗, 生物安全性, 国家自然科学

Abstract:

BACKGROUND: Transfusion of bone marrow mesenchymal stem cells may become a novel and effective biological therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice. Nevertheless, the oncological safety of the treatment is worrisome, and is a key to determine whether mesenchymal stem cells can be widely used in treatment of inflammatory bowel disease, and deserves further investigation.

OBJECTIVE: To evaluate the therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cell transfusion against inflammatory bowel disease in mouse models, and to clarify the effects of mesenchymal stem cells on tumorigenesis of inflammatory bowel disease.

METHODS: Mouse model of colitis was established using Balb/c (H-2d) mice exposed to dextran sulfate sodium. Syngeneic bone marrow mesenchymal stem cells were transfused into mouse model through caudal vein. The therapeutic effect of mesenchymal stem cells was compared and observed, and pathological remission of colitis was evaluated. Mouse model of colitis-driven colon carcinogenesis was established using Balb/c (H-2d) mice exposed to dextran sulfate sodium and azoxymethane. Tumor formation within the murine colon was compared and observed after transfusion of mesenchymal stem cells.

RESULTS AND CONCLUSION: In models of dextran sulfate sodium-induced colitis, weight loss and fecal occult blood were lessened in the bone marrow mesenchymal stem cell group compared with the phosphate buffered saline group. Histological damage score of colitis was less in the bone marrow mesenchymal stem cell group: mucosal structure of distal colon was almost intact under microscope, and there was small area of epithelial defects and cryptal defects. Inflammatory cell infiltration, proliferation of capillary and small vessels could be observed in mucosa and submucosa. Homing and colonization of mesenchymal stem cells in submucosa of inflamed colon could also be observed by in vivo tracing. In the dextran sulfate sodium/azoxymethane model of colitis-driven colon carcinogenesis, the number of intestinal tumors and tumor load were obviously less in the bone marrow mesenchymal stem cell group than in the control group. Results indicated that transfusion of bone marrow mesenchymal stem cells can apparently improve colitis lesions of mice with inflammatory bowel disease and inhibit carcinogenesis of colitis, which may provide theoretical support for the biological safety of mesenchymal stem cells transplantation for inflammatory bowel disease.

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Key words: colitis, neoplasms, gastrointestinal neoplasms, mesenchymal stem cells, mesenchymal stem cell transplantation

中图分类号:

R394.2

何小文，陈泽贤，张珑涓，何晓生，练磊，柯嘉，林绪涛，陈曦，吴小剑，兰平. 骨髓间充质干细胞移植治疗炎症性肠病小鼠结肠炎的有效性及肿瘤学安全性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(23): 3696-3701.

He Xiao-wen, Chen Ze-xian, Zhang Long-juan, He Xiao-sheng, Lian Lei, Ke Jia, Lin Xu-tao, Chen Xi, Wu Xiao-jian, Lan Ping. Efficacy and oncological safety of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for colitis in inflammatory bowel disease models in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(23): 3696-3701.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 实验选用40只小鼠，分别构建实验性结肠炎模型和小鼠结肠炎癌变模型，并进入分组实验，所有小鼠无意外死亡，均进入实验结果分析阶段。

2.2 骨髓间充质干细胞的生物学特性鉴定 骨髓间充质干细胞经扩增传代3代以后，获得形态比较均一的梭形细胞，平行排列或旋涡样单层集落生长，也可见多角形和扁平状细胞。相差显微镜下细胞核浆比大，胞浆少，核大，核仁明显。应用流式细胞检测显示，骨髓间充质干细胞不表达CD34，CD45和MHCⅡ类分子，高表达CD29，CD44和MHCⅠ类分子。体外经成骨诱导培养两至三周后，大多数细胞发生形态变化，由原来的梭形变为多角形或不规则形，细胞呈结节状生长，并有钙盐沉积，茜素红S染色证实有骨钙结节形成(图1A)；成脂诱导分化2周后，细胞内可见融合成团、被油红O染成红色的脂滴(图1B)。

2.3 输注间充质干细胞从临床和组织学水平有效控制小鼠结肠炎 尽管对照组结肠炎小鼠在停止饮用葡聚糖硫酸钠后症状趋向逐渐好转，但治疗组小鼠恢复更加明显，腹泻、便血明显好转，实验结束时体质量丧失、粪便黏稠度(不成形黏稠大便)、大便潜血较对照组均有减轻。镜下，间充质干细胞治疗组小鼠远端结肠黏膜结构基本完整，有小范围上皮缺损或隐窝缺损，黏膜层和黏膜下层较多炎症细胞浸润，可见毛细血管和小血管增生。而对照组小鼠远端结肠黏膜结构较紊乱，有较大范围上皮缺损或部分隐窝消失，见少量隐窝脓肿，黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润，包括中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞(图2)。间充质干细胞治疗组小鼠结肠远端组织炎症损伤严重度评分低于对照组(P < 0.05；图3)。

2.4 输注的间充质干细胞向炎症肠道组织归巢定殖 体外CM-DiI标记间充质干细胞，显示细胞膜和胞浆质膜被标上染料，胞核无标记，标记率在90%以上。

组织标本冰冻切片可见有CM-DiI标记的间充质干细胞向结肠远端炎症病变处归巢定殖，且主要位于黏膜下层(图4)，同一小鼠结肠近端及小肠组织内未见CM-DiI标记的细胞。

2.5 输注间充质干细胞对小鼠结肠炎癌变具有抑制作用 建立Balb/c(H-2d)小鼠的炎症性肠病癌变模型，在建模周期的前3周经尾静脉输注同系小鼠骨髓间充质干细胞3次。建模结束后观察肠道肿瘤形成的情况，如图5，结果显示经间充质干细胞治疗的小鼠肠道肿瘤数量及肿瘤负荷(单只小鼠肿瘤的直径之和)明显少于对照组(P < 0.05)。

参考文献

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年3至12月在中山大学实验动物中心及中山大学胃肠病学研究所完成。

材料：

实验动物：SPF级健康雌性3周龄(n=20)及7周龄(n=40)Balb/c(H-2d)小鼠，购自中山大学实验动物中心，动物许可证号SCXK(粤)2004-0011，在(22±1)℃恒温房内饲养，12 h光照和12 h避光循环交替，自由进食和饮水。所有动物实验方案遵守中山大学实验动物伦理委员会的有关规定。

实验方法：

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增及鉴定：取3周龄SPF级雌性Balb/c(H-2d)小鼠，参照文献[10]获取骨髓细胞，用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养液，置37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养。培养48 h后首次换液，去除大量悬浮生长的造血细胞，之后每三四天更换培养液1次，当细胞达到80%以上融合时进行传代。

应用FITC标记的抗小鼠CD29，CD45，MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ及PE标记的抗小鼠CD34，CD44，以流式细胞仪鉴定间充质干细胞的免疫表型。参考文献[11]进行成骨、成脂诱导分化实验以检测其分化潜能(分别使用茜素红S和油红O染色)。取第三、四代骨髓间充质干细胞用于后续实验。

输注骨髓间充质干细胞对小鼠实验性结肠炎治疗的组织病理学评价：取7周龄SPF级雌性Balb/c(H-2d)小鼠12只，适应环境1周后，参考文献[12]，给予4%葡聚糖硫酸钠自由饮用7 d，然后随机等分为间充质干细胞组和PBS组。间充质干细胞组分别于实验第2，5，8天经尾静脉注射0.3 mL含1×10⁶间充质干细胞的PBS细胞悬液，对照组则经尾静脉注射PBS。实验期间每天定时对实验动物进行临床评估，包括体质量、大便性状(黏稠度)、便血指征(大便隐血或肉眼血便)以及饮食、饮水情况。实验第15天，颈椎脱臼处死动物，切取整段结肠，分别剪取治疗组和对照组小鼠结肠远端、中段及近端长度为1 cm的肠管组织， 40 g/L甲醛固定过夜，常规石蜡包埋，4 μm连续切片。苏木精-伊红染色，常规倒置显微镜检查，明确炎症反应及上皮损害程度分级，并参考文献[13]进行组织炎症损伤严重度评分。具体评分标准为：①炎症细胞浸润程度(0：无明显炎症细胞，1：浸润黏膜固有层，2：浸润黏膜+黏膜下，3：透壁浸润)。②黏膜损伤(0：正常形态，1：轻-中度上皮缺损，2：较大范围上皮缺损，3：隐窝缺损，4：较大范围隐窝缺损)，每张切片的组织评分为2项得分之和。

输注的骨髓间充质干细胞向炎症肠道的归巢实验：体外培养的间充质干细胞贴壁后，以PBS洗涤3次，加入 2 mg/L CM-DiI工作液，37 ℃孵育5 min，再转至4 ℃孵育15 min，吸除CM-DiI工作液，PBS轻柔洗涤3次，胰酶消化制备3.5×10⁹ L^-¹间充质干细胞单细胞悬液。同前制备小鼠实验性结肠炎模型，于实验第8天经尾静脉注射CM-DiI标记的间充质干细胞。实验第15天，处死动物，分别切取结肠远端、中段、近端及小肠长度为1 cm的肠管，立即置入-80 ℃保存。冰冻切片，层厚5 μm，以Ti-U倒置荧光显微镜观察(荧光激发波长553 nm，发射波长570 nm)。

小鼠结肠炎癌变模型输注骨髓间充质干细胞对小鼠结肠炎恶性转化的影响：参考文献[14]构建小鼠结肠炎癌变模型。取7周龄SPF级雌性Balb/c(H-2d)小鼠10只随机等分为间充质干细胞组和PBS组，适应环境1周后，于实验第1天腹腔注射偶氮氧甲烷10 mg/kg，2%葡聚糖硫酸钠饮水1周后接正常饮水2周为一周期，总共进行3周期。间充质干细胞组分别于实验第1，2，3周末经尾静脉注射0.3 mL含1×10⁶间充质干细胞的PBS细胞悬液，对照组则经尾静脉注射PBS。实验结束后处死小鼠，分离结肠，观察小鼠肠道肿瘤形成情况。

主要观察指标：①葡聚糖硫酸钠结肠炎小鼠模型中间充质干细胞实验组及对照组结肠炎症病变的病理学改善情况及组织炎症损伤严重度评分。②葡聚糖硫酸钠结肠炎小鼠模型中间充质干细胞输注后向炎症肠道的归巢分布情况。③葡聚糖硫酸钠/偶氮氧甲烷结肠炎癌变小鼠模型中，间充质干细胞实验组及对照组结肠肿瘤的形成情况。

统计学分析：结果以x(_)±s表示，用SPSS 15.0统计软件包(美国SPSS公司)进行处理。两组数据间采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

随着对炎症性肠病发病机制的不断阐明和认识的不断深入，目前普遍认为炎症性肠病的发生是遗传易感个体，在环境因素及肠道菌丛的参与下，启动肠道黏膜免疫及非免疫系统，在抗原的持续刺激和免疫调节紊乱持续存在的情况下，导致炎症级联的放大和局部炎症递质对组织的损伤。其中，黏膜免疫功能的失调是炎症性肠病发生并呈慢性持续状态的中心环节。因此，以炎症/免疫调节为主的生物治疗将是炎症性肠病治疗的重要方向。骨髓间充质干细胞具有低免疫原性、免疫负性调节/抗炎、修复受损组织等多种特性^[15-16]，同时又具有细胞来源广泛，易于分离、体外培养和扩增等特点，使其在炎症性肠病的治疗方面显示出了诱人的临床应用前景^[1-4]。Forbes等^[4]开展的一项开放、多中心的临床试验对同种异体间充质干细胞治疗难治型克罗恩病(对infliximab或adalimumab难治性，克罗恩病疾病活动指数>250)的有效性进行了研究，结果显示，完成治疗的15例患者中，在治疗第42天，克罗恩病疾病活动指数评分平均由370降至203，其中12例有临床反应，有8例临床缓解，7例患者内镜下黏膜损伤得到改善。实验在小鼠葡聚糖硫酸钠结肠炎模型上，证实经外周静脉输注骨髓间充质干细胞能明显改善葡聚糖硫酸钠诱导的急性结肠炎小鼠的症状及肠道组织炎症。

已有研究表明，间充质干细胞可向炎症组织归巢而发挥作用^[17]。作者采用荧光示踪染料CM-DiI标记体外培养的间充质干细胞，经尾静脉输入葡聚糖硫酸钠结肠炎小鼠体内，冰冻病理结果显示标记的间充质干细胞存在于结肠炎症病变组织，主要位于黏膜下层，而结肠近端及小肠未见有标记间充质干细胞的归巢，提示间充质干细胞能被招募迁移到肠道炎症病变部位。

炎症性肠病炎症是一种癌前病变，可发生恶性转化，约2.7%的炎症性肠病患者在病程30年内发生癌变，约一半的癌变患者最终因罹患结直肠癌而死亡^[5]。炎症本身在炎症性肠病的癌变发生发展进程中起着决定性作用，动物及人体研究均提示抗炎治疗能降低炎症性肠病癌变的风险^[18-25]。那么，似乎有理由推测，输注骨髓间充质干细胞，不仅仅控制炎症性肠病炎症，也可能抑制炎症性肠病恶性转化的进程。然而，目前在乳腺癌等肿瘤的研究中却显示间充质干细胞可能会通过免疫抑制、向肿瘤间质成分分化、或参与肿瘤微血管的构建，形成一个利于肿瘤生长的微环境^[7-9]；但这些证据是直接在肿瘤模型上给予间充质干细胞后进行实验而得出的，并不能反映在肿瘤形成的漫长转化进程中，给予间充质干细胞对肿瘤形成所起的作用。人类炎症性肠病的恶变是一个漫长的演变过程，输注骨髓间充质干细胞对炎症性肠病恶性转化的影响很难直接在人体身上进行研究，势必需要良好的动物模型来模拟人体内炎症性肠病炎症到癌变的转化过程。应用葡聚糖硫酸钠联合偶氮氧甲烷构建的小鼠结肠炎相关肠癌模型，周期较短、方法简便、成瘤率高，能在病理及分子机制方面较好地模拟人类炎症性肠病炎症向癌变转化过程的情况^[14]。为探讨输注间充质干细胞对炎症性肠病炎症向肿瘤转化的影响，应在结肠炎诱导之后、肿瘤未发生之前给予治疗剂量的间充质干细胞，而不是在形成肿瘤后给予，否则不能反映间充质干细胞对炎症性肠病炎症恶性转化的作用。作者所在课题组预实验，已从大体及组织病理学角度证实在第2个循环葡聚糖硫酸钠喂养期间(第4周)，动物模型无肠道肿瘤形成的证据，由此确保实验中输注间充质干细胞是在模型发生恶变之前。实验发现，在炎症阶段输注间充质干细胞能明显抑制炎症性肠病小鼠肠道肿瘤的形成。实验结果提示间充质干细胞在治疗炎症性肠病的过程中，不会促进/加速炎症性肠病的癌变进程。间充质干细胞抑制炎症性肠病的癌变，可能通过控制炎症反应从而达到阻断炎症向肿瘤的演变，也可能通过直接的免疫调节或其他通路直接阻断炎症的恶性转化过程，其具体机制如何，还有待更深入的研究来阐明。

综上所述，实验通过动物模型验证了输注骨髓间充质干细胞对炎症性肠病结肠炎治疗的有效性，并首次证实间充质干细胞能抑制而非促进炎症性肠病的恶性转化，为间充质干细胞治疗炎症性肠病的生物安全性及合理应用提供了客观的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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延伸阅读

1实验设计构思介绍：

骨髓间充质干细胞有望成为临床治疗炎症性肠病最有前景的方法之一。炎症性肠病是一种癌前病变，可恶性转化为肿瘤，间充质干细胞在治疗炎症性肠病过程中，不仅仅是控制炎症，也能够从机理上阻抑炎症性肠病的癌变进程吗？在乳腺癌等肿瘤的研究中显示间充质干细胞可能参与肿瘤间质形成、成血管作用及免疫抑制，间充质干细胞在治疗炎症性肠病的同时是否会加速/促进炎症性肠病的癌变？回答上述问题是决定间充质干细胞能否广泛应用的关键。为此，通过建立小鼠结肠炎相关肠癌模型，模拟人类炎症性肠病炎症到癌变的漫长转化过程，明确间充质干细胞在治疗炎症性肠病中是抑制或是促进炎症性肠病炎症癌变，为间充质干细胞治疗炎症性肠病的生物安全性提供客观依据。

2国内外同类研究水平的介绍：

国内外临床及基础研究均提示输注骨髓间充质干细胞有望成为炎症性肠病治疗的新的有效的生物治疗手段。但与此同时，其生物安全性问题等相关基础研究仍任重道远。目前对于间充质干细胞在治疗炎症性肠病中的肿瘤学安全性问题，即间充质干细胞是否会促进炎症性肠病的恶性转化？目前尚未见相关研究报道。

3与其他同类研究的比较：

目前在乳腺癌等肿瘤的研究中显示，间充质干细胞参与肿瘤间质形成、成血管作用及免疫抑制等特性可能促进肿瘤进展。但这些证据均是直接在肿瘤模型上给予间充质干细胞后进行实验而得出的，并不能反映在肿瘤形成的漫长转化进程中（例如，炎症到肿瘤的动态演变），即在肿瘤发生之前，给予间充质干细胞对肿瘤形成所起的作用。本文通过构建小鼠结肠炎相关肠癌模型，模拟人体炎症性肠病炎症到肿瘤的漫长转化过程，来探讨在炎症性肠病恶变发生之前，输注骨髓间充质干细胞对炎症性肠病恶性转化的影响。

4文章创新性：

明确间充质干细胞在治疗炎症性肠病中的远期肿瘤学安全性-抑制或促进炎症性肠病炎症癌变，是决定骨髓间充质干细胞能否广泛应用于临床的关键。目前对于间充质干细胞在治疗炎症性肠病中的远期安全性尚无相关临床证据报道，首次利用炎症性肠病炎症癌变动物模型，模拟炎症性肠病炎症向肿瘤转化的漫长过程，探讨输注骨髓间充质干细胞对炎症性肠病恶性转化的影响，将为间充质干细胞治疗炎症性肠病的安全性提供理论依据，也为间充质干细胞的合理临床应用提供理论支持和更好的保证。

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骨髓间充质干细胞移植治疗炎症性肠病小鼠结肠炎的有效性及肿瘤学安全性

Efficacy and oncological safety of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for colitis in inflammatory bowel disease models in mice

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